Biochemische Labormethoden

Inhaltsverzeichnis

1 Quantitative Methoden.- 1.1 Quantitative Proteinbestimmungen.- 1.1.1 Proteinbestimmung nach LOWRY u. Mitarbeitern.- 1.1.1.1 Standardmethode.- 1.1.1.2 Mikromethode.- 1.1.2 Proteinbestimmung nach LOWRY u. Mitarbeitern in Gegenwart störender Begleitsubstanzen.- 1.1.3 Proteinbestimmung nach BRADFORD.- 1.1.4 Proteinbestimmung in Probenlösungen für die SDS-Gelelektrophorese.- 1.1.5 Proteinbestimmung mit Amidoschwarz.- 1.1.6 Mikro-Biuret-Methode.- 1.1.7 Proteinbestimmung mit BCA (Bicinchoninsäure).- 1.1.7.1 Standardmethode.- 1.1.7.2 Mikromethode.- 1.1.8 Proteinbestimmung nach KJELDAHL.- 1.1.9 Protein-Konzentrationsbestimmung durch UV-Absorptionsmessung (Photometrie).- 1.2 Quantitative Nucleinsäurebestimmungen.- 1.2.1 DNA-, RNA- und Proteintrennungsgang nach SCHMIDT und THANNHAUSER.- 1.2.2 RNA-Bestimmung mit Orcin.- 1.2.3 DNA-Bestimmung mit Diphenylamin.- 1.2.4 DNA- bzw. RNA-Bestimmung in Gewebehomogenaten.- 1.2.5 Quantitative Nucleinsäurebestimmung durch UV-Messung.- 1.3 Quantitative Phosphatbestimmung.- 1.3.1 Bestimmung von anorganischem Phosphat.- 1.3.2 Bestimmung von Gesamt-Phosphat.- 1.3.3 Phospholipid-Bestimmung.- 1.4 Monosaccharid-Bestimmung.- 1.5 Auswertung quantitativer Analysen.- 2 Elektrophorese.- 2.1 Elektrophoresesysteme.- 2.1.1 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach LAEMMLI.- 2.1.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach WEBER, PRINGLE und OSBORN.- 2.1.3 Harnstoff-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese zur Trennung nierdermolekularer Proteine.- 2.1.4 TRICINE-SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese für Proteine und Oligopeptide im Molmassenbereich von 1000 bis 50.000 Dalton.- 2.1.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei pH 2.4.- 2.1.6 Harnstoff-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bei pH 2.- 2.1.7 Anodisches diskontinuierliches Polyacrylamid-Gelelektrophoresesystem.- 2.1.8 Kathodisches diskontinuierliches Polyacrylamid-Gelelektrophorese-System.- 2.1.9 Zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophorese (IEF und SDS-PAGE).- 2.1.9.1 Erste Dimension: Isoelektrische Fokussierung (IEF).- 2.1.9.2 Zweite Dimension: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.- 2.1.10 Nicht-denaturierende Nucleinsäure-Elektrophorese.- 2.1.11 Denaturierende Nucleinsäure-Elektrophorese.- 2.1.12 Identifizierung von Phosphoaminosäuren (Papierelektrophorese).- 2.2 Hilfsmittel für die Kontrolle der Elektrophorese.- 2.2.1 Markerfarbstoffe für die Kontrolle der Elektrophorese.- 2.2.1.1 Anodische Systeme.- 2.2.1.2 Kathodische Systeme.- 2.2.2 Eichproteine für die Polyacrylamid-Gelelektrophorese.- 2.2.3 Kovalente Farbmarkierung von Eichproteinen.- 2.3 Färbemethoden.- 2.3.1 Proteinfärbung mit organischen Farbstoffen.- 2.3.1.1 Amidoschwarz 10 B.- 2.3.1.2 Coomassie Brilliant Blue R250 bzw. G250.- 2.3.1.3 Fast Green.- 2.3.1.4 Stains All.- 2.3.2 Silberfärbung von Proteinen (Glutaraldehyd-Fixierung).- 2.3.2.1 Citrat/Formaldehyd-Entwicklung.- 2.3.2.2 Alkalische Entwicklung.- 2.3.2.3 Silberfärbung mit Wolframatokieselsäure.- 2.3.2.4 Kontraststeigerung nach BERSON.- 2.3.3 Silberfärbung von Proteinen (Formaldehyd-Fixierung).- 2.3.4 Silberfärbung von Glycoproteinen und Polysacchariden.- 2.3.5 Abschwächen von silbergefärbten Gelen.- 2.3.6 Färbung von Proteinen auf Blotting-Membranen.- 2.3.6.1 Färbungen auf Nitrocellulose-Blotting-Membranen mit Farbstoffen ..- 2.3.6.2 Proteinfärbung auf Nitrocellulose-Blotting-Membranen mit Tusche ..- 2.3.6.3 Färbung auf Nitrocellulose mit kolloidalem Gold.- 2.3.6.4 Proteinfärbung auf PVDF-Blotting-Membranen mit Farbstoffen.- 2.3.7 Färbung von Proteolipiden bzw. Lipiden und Lipoproteinen.- 2.3.8 Färbung von Glycoproteinen und Polysacchariden.- 2.3.8.1 Färbung mit Schiffschem Reagens (PAS staining).- 2.3.8.2 Färbung mit Thymol.- 2.4 Elektroelution aus Gelen.- 2.4.1 Quantitative Elektroelution von Proteinen aus Polyacrylamid-Gelen.- 2.4.2 Entfernung von SDS.- 2.4.3 Elektrotransfer von Proteinen (Western blot).- 2.4.4 Immunchemischer Antigennachweis nach Elektrotransfer.- 2.4.4.1 Detektion von Meerrettich-Peroxidase (POD).- 2.4.4.2 Detektion von alkalischer Phosphatase (AP).- 2.4.5 Chemoluminiszenz-Detektion auf Blotting-Membranen.- 2.4.6 Kohlenhydrat-spezifische Glycoprotein-Detektion nach Elektrotransfer.- 2.4.7 Allgemeiner Kohlenhydrat-Nachweis auf Western blots.- 2.4.8 Transfer von Nucleinsäuren (Southern-bzw. Northern-Blot).- 2.5 Trocknung von Elektrophoresegelen.- 2.6 Autoradiographie von radioaktiv markierten Verbindungen in Elektrophoresegelen.- 3 Chromatographische Methoden.- 3.1 Dünnschichtchromatographie.- 3.1.1 Bestimmung der N-terminalen Aminosäure im Polypeptid (Dünnschichtchromatographie von modifizierten Aminosäuren).- 3.1.2 Trennung von Nucleosidphosphaten.- 3.1.2.1 Gradienten-Dünnschichtchromatographie.- 3.1.2.2 Nachweis von Phosphaten.- 3.1.3 Lipidextraktion und Dünnschichtchromatographie von Lipiden.- 3.2 Säulenchromatographie.- 3.2.1 Praktische Hinweise zur Säulenchromatographie von Proteinen.- 3.2.2 Konzentrierung von Proteinlösungen.- 3.2.2.1 Säurefällung.- 3.2.2.2 Aussalzen.- 3.2.2.3 Ausfällen mit organischen Verbindungen.- 3.2.2.4 Lyophilisation.- 3.2.2.5 Ultrafiltration.- 3.2.3 Gelfiltration.- 3.2.3.1 Auswahl des Trägermaterials.- 3.2.3.2 Füllen einer Gelfiltrationssäule.- 3.2.3.3 Probenauftrag und Elution.- 3.2.3.4 Reinigung.- 3.2.3.5 Bestimmung von Ausschlußvolumen Vo und Gesamtvolumen Vt.- 3.2.4 Ionenaustauschchromatographie.- 3.2.4.1 Vorbehandlung von Ionenaustauscher-Materialien.- 3.2.4.2 Test der Bindungsbedingungen.- 3.2.4.3 Probenauftrag.- 3.2.4.4 Elution.- 3.2.4.5 Reinigung und Regenerierung.- 3.2.5 Hydrophobe Chromatographie.- 3.2.5.1 Test der Bindungsbedingungen.- 3.2.5.2 Elution.- 3.2.5.3 Regenerierung.- 3.3 Affinitätschromatographie.- 3.3.1 Bromcyan-Aktivierung von Polysaccharid-Chromatographieträgern.- 3.3.2 Kopplung an Bromcyan-aktivierte Gele.- 3.3.2.1 Bestimmung des gebundenen Diamin-Spacers.- 3.3.3 Herstellung Chlorameisensäureester-aktivierter Perlcellulosen.- 3.3.3.1 Aktivierung mit C1COONB.- 3.3.3.2 Bestimmung des Aktivierungsgrades von C1COONB-aktivierter Perlcellulose durch HONB-Messung.- 3.3.4 Kopplung von Liganden an C1COONB-aktivierte Perlcellulose.- 3.3.4.1 Kopplung von Weizenkeim-Lektin an C1COONB-aktivierte Perlcellulose.- 3.3.5 Kopplung von Reaktivfarbstoffen an Polysaccharide (Farbstoff-Affinitätschromatographie).- 3.3.6 Kovalente Bindung von Biotin (Biotin-Avidin/Streptavidin-System).- 3.4 Hochauflösende Ionenaustausch-Chromatographie (HPIEC) von Mono-und Oligosacchariden.- 4 Immunchemische Methoden.- 4.1 Konjugation von Haptenen (Peptiden) an Carrier-Proteine.- 4.1.1 Aktivierung von Carrier-Proteinen.- 4.1.2 Konjugation.- 4.1.3 Immunisierung.- 4.2 Ammonsulfat-Fraktionierung von Immunoglobulinen.- 4.3 Heidelberger-Kurve.- 4.4 Doppelt-radiale Immunodiffusion nach OUCHTERLONY.- 4.4.1 Reinigung des Agars.- 4.4.2 Vorbereitung der Platten.- 4.4.3 Immundiffusion.- 4.4.4 Sichtbarmachung der Präzipitationslinien.- 4.5 Immunopräzipitation von Antigenen.- 4.6 Immunelektrophorese.- 4.7 Gegenstromelektrophorese.- 4.8 dot-blot-Test.- 4.9 Enzym-Immunosorbent-Test (EIA bzw. ELISA).- 4.10 Meerrettichperoxidase-Immunoglobulin-Konjugat (Glutaraldehyd-Methode).- 4.10.1 Affinitätschromatographische Reinigung von Meerrettichperoxidase.- 4.10.2 Affinitätschromatographie von Immunoglobulin.- 4.10.3 Glutaraldehyd-Konjugation.- 4.11 Alkalische Phosphatase-Immunoglobulin-Konjugat (Glutaraldehyd-Methode).- 4.11.1 Konjugation.- 4.11.2 Indikatorreaktion für AP.- 4.12 Kopplung (Konjugation) von Glycoproteinen.- 4.13 Protein-kolloidales-Gold-Komplex.- 4.13.1 Herstellung des Goldsols.- 4.13.2 Proteinbeladung.- 5 Zentrifugation.- 5.1 Differentialzentrifugation.- 5.2 Dichtegradientenzentrifugation.- 5.2.1 Stufengradientenzentrifugation.- 5.2.2 Saccharosegradientenzentrifugation.- 5.2.2.1 Präparation von Oberflächenmembranen (Sarkolemm, SL) des Herzmuskels.- 5.2.2.2 Enzym-Bestimmung: Oubain-sensitive Na,K-ATPase.- 5.2.2.3 Rezeptor-Bestimmung: DHP-Bindungsstellen in der Oberflächenmembran.- 5.2.2.4 Bestimmung der Dissoziations-und Assoziationskinetik des DHP-Rezeptors.- 5.2.2.5 Nicht-denaturierender Saccharosegradient zur RNA-Trennung.- 5.2.2.6 Denaturierende RNA-Gradientenzentrifugation.- 5.2.3 Isopyknische Zentrifugation.- 5.2.3.1 Reinigung hochmolekularer DNA im CsC1-Gradienten.- 5.2.3.2 Zellfraktionierung mittels Percoll.- 5.2.3.3 Leukozytenpräparation.- 5.3 Drehzahl-Zentrifugalbeschleunigungs-Nomogramme.- 6 Radioaktive Markierung.- 6.1 [32P]-Phosphat-Inkorporation in Proteine.- 6.2 Iodierung mit [125I]-Iodverbindungen.- 6.2.1 Chloramin-T-Methode.- 6.2.2 Iodierung mit Bolton-Hunter-Reagens.- 6.3 Radioaktiver Zerfall.- 6.4 Zerfallstabellen für [32P]Phosphor, [35S]Schwefel und [125I]Iod.- 6.5 Szintillator-Lösungen für die Flüssigszintillationsmessung.- 7 Puffersysteme.- 7.1 pK-Werte und Molmassen von Puffersubstanzen.- 7.2 Diagramm zur Pufferberechnung.- 7.3 pH-Farbindikatoren.- 7.4 Pufferlösungen.- 7.4.1 Häufig verwendete Pufferlösungen.- 7.4.2 Puffer bzw. Medien für Gewebe-und Zellkulturen bzw. Organperfusion.- 7.4.3 pH-Eichpuffer.- 7.4.4 Flüchtige Puffer.- 8 Reinigungsvorschriften für ausgewählte Laborchemikalien.- 8.1 Reinigungsmittel.- 8.2 Reinigungsvorschriften für einige Laborchemikalien.- 9 Tabellen.- 9.1 Konzentrationsmaße.- 9.2 Umrechnung SI-fremder Maßeinheiten in SI-Einheiten.- 9.3 Molmassen und andere Stoffdaten häufig verwendeter Substanzen.- 9.4 Proteindaten.- 9.5 Protease-Inhibitoren.- 9.6 Aminosäure-Einbuchstabencode und Molmassen der Aminosäuren.- 9.7 Spektroskopische Daten von Nucleotiden.- 9.8 Stoffwerte von Detergenzien (Tensiden).- 9.9 Brechungsindex und Dichte von Saccharose-Lösungen.- 9.10 Ammoniumsulfat-Tabelle.- 9.11 Angaben zur Herstellung verdünnter Lösungen.- 9.12 Mischungskreuz.- 10 Anhang.- 10.1 Statistische Formeln.- 10.1.1 Mittelwert und zusammenhängende Größen.- 10.1.2 Ausgleichsgerade (lineare Regression).- 10.1.3 t-Test.- 10.2 Formeln zur Versuchsauswertung.- 10.2.1 Rezeptorbindungsstudien.- 10.2.2 Enzymkinetik.- 10.2.3 Molmassenbestimmung in SDS-Elektropherogrammen.- 10.3 Software für die Laborpraxis.- 10.3.1 Datenauswertung und -präsentation.- 10.3.2 Statistik-Programme.- 10.3.3 Sonstiges.